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离子交换蛋白纯化系统的基本操作
发布时间:2016-08-21   点击次数:518次
离子交换蛋白纯化系统为蛋白等生物样品的纯化制备而专门设计,高性能输液泵不仅耐受高压,而且在低温低压下具有良好的稳定性,为低压色谱柱提供安全保证;采用DAD检测器,可方便实时监测分离组分的纯度。另外,SCG配备酸度/电导检测器可即时监测分离时的梯度环境。
 
离子交换蛋白纯化系统的基本操作  
1、DEAE-纤维素的预处理:  
称取2gDE-52,置于砂芯漏斗中,先在20mL0.5mol/LNaOH中浸泡30min,然后用蒸馏水淋洗至pH=8.0,再用20mL0.5mol/LHCl浸泡30min,然后用蒸馏水淋洗至pH=4.0。zui后用20mL0.5mol/LNaOH浸泡30min后蒸馏水洗至pH=8.0。用洗脱液A浸泡已处理好的DEAE—纤维素,并更换1~2次。
2、装柱取1.5ⅹ20cm层析柱一根,如图1装柱。装入约10mL洗脱液A,打开下活塞让缓冲液慢慢滴出,同时,将悬浮于适量洗脱液A中的DEAE—纤维素一边搅动一边倒入层析柱中,让其自然沉降到全部加入为止。用洗脱液A以1.0ml/min的流速平衡柱子,直到流出液pH与起始缓冲液的完全相同为止。
注:装柱时交换剂zui好一次倒入,若分次倒入时,则须在再次添加之前将界面处的交换剂搅起,以保证柱床不分节。柱面要平整,柱中无气泡。
3、上样
上述平衡过程完毕后,待液面离纤维素沉降面约1cm后,关闭活塞。用滴管将样品沿管壁小心加入,待全部样品进入柱后,在柱床面上加一层洗脱液A。上样量占柱体积的2.5%左右。
4、洗脱
连接洗脱瓶,打开柱下口开始洗脱。先用洗脱液A洗脱1个柱体积(收集在一个试管中),流速约0.5ml/min;然后用洗脱液B中5个梯度分别洗脱一个柱体积,分别收集,流速约0.5ml/min。
5、鉴定收集各个洗脱组分,紫外吸收法测定每个组分的蛋白含量。

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