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蛋白纯化系统常用技术和程序步骤
发布时间:2017-08-10   点击次数:525次
蛋白纯化系统常用技术
1、沉淀
2、电泳:蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中是带电的,在电场中能向电场的正极或负极移动。根据支撑物不同,有薄膜电泳、凝胶电泳等。
3、透析:利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。
4、层析:
a.离子交换层析,利用蛋白质的两性游离性质,在某一特定PH时,各蛋白质的电荷量及性质不同,故可以通过离子交换层析得以分离。如阴离子交换层析,含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。
b.分子筛,又称凝胶过滤。小分子蛋白质进入孔内,滞留时间长,大分子蛋白质不能同时入孔内而径直流出。
5、超速离心:既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。不同蛋白质其密度与形态各不相同而分开。
 
蛋白纯化系统的一般程序可分为以下几个步骤:
材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有:
1.机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2.渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3.反复冻融法
生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4.超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5.酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
 
蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂,使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。

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